检查抗精子抗体的方法

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　　抗精子抗体是指男性或者女性，对男性精液有抵抗作用，使精子无法正常和卵子结合，导致不孕不育的发生。抗精子抗体是一个复杂的病理产物，男女均可罹患，其确切原因尚未完全明了。那么，抗精子抗体怎么检查啊？

　　1、酶联免疫吸附试验

　　（1）精子抗原制备：筛选收集精液常规检查正常的精液，用生理盐水反复离心洗涤，尽可能除去精浆，经超声波超声粉碎，10～ 15min 高速离心，吸上清，测定上清液蛋白浓度，将蛋白浓度稀释为 3.5～ 5.0μg/mL，为精子抗原溶液。

　　（2）反应板包被抗原：将人精子抗原稀释成 3.5～ 5μg/mL，包被液加到聚氯乙烯微量测定板内，每孔 100μL，置 4℃ 冰箱过夜。

　　（3）封闭处理：次日早晨，倾去抗原溶液，用洗涤 PBS洗 3次，每次 5min，每次洗涤后都要将板在纸上拍干，再加入 1% 的聚乙烯醇溶液 200μL封闭，置室温 1h后同上法洗涤。

　　（4）加待测样品：样品用 PBS稀释 100倍，每孔加入 100μL，同时加 As-Ab血清及正常处女血清作分别阳性和阴性对照，置 37℃ 温育 1h，同上法洗涤。

　　（5）加酶结合物：HRP-Protein A 以 1∶640稀释，每孔加入 100μL，置室温 1h，同上洗涤。

　　（6）酶反应：加新鲜配制的 OPD 底物溶液，每孔加入 50μL，置室温暗处 10min，再加10% H2SO4终止液每孔 50μL。

　　（7）结果判定：用酶标测定仪 490μm测其 OD 值，OD 值≥2.0时为阳性。

　　2、生物素-亲和素酶联免疫吸附试验

　　（1）在 40孔微量测定板中加入 2～ 6μg/mL人精子膜抗原包被液，每孔 100μL，4℃ 过夜。加 1% 聚乙烯醇封板 37℃ 、30min，用洗液洗 3次。

　　（2）待检血清 1∶1000稀释（宫颈黏液 1∶100）每孔 100μL，37℃ 温育 60min，同上洗涤。

　　（3）1∶100生物素化羊抗人 IgG，IgA 或 IgM，每孔 100μL，37℃ 、60min，同上洗涤。

　　（4）1∶100酶标亲和素，每孔 100μL，22℃ 温育 30min，同上洗涤。

　　（5）每孔加底物 100μL，37℃ 作用 5～ 10min，加 8mol/L H2SO450μL 终止反应。

　　（6）用酶标检测仪测 A490光密度（OD）值，为双份待测孔均值与双份阴性孔均值之差，血清取 OD 值 0.20（宫颈黏液取 0.10）作为 AsAb阳性的判断标准。

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